S-腺苷甲硫氨酸(SAM)竞争法ELISA试剂盒技术解析与应用

实验原理

本试剂盒采用竞争法酶联免疫吸附试验（ELISA）。在预包被抗S-腺苷甲硫氨酸（SAM）抗体（固相抗体）的微孔酶标板中，加入S-腺苷甲硫氨酸（SAM）校准品和待测样本，再加入HRP标记的S-腺苷甲硫氨酸（SAM）抗原（酶标抗原），经过温育与充分洗涤，去除未结合的组分，在微孔板固相表面形成固相抗体-酶标抗原的免疫复合物。加底物A和B，底物在HRP催化下，产生蓝色产物，在终止液（2M 硫酸）作用下，最终转化为黄色，在酶标仪450nm波长上测定吸光度（OD值），吸光度（OD值）与待测样品中S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的浓度负相关。拟合校准品曲线，可以计算出样本中S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的浓度。

S-腺苷甲硫氨酸(SAM)竞争法ELISA试剂盒技术解析与应用

摘要

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)是生物体内重要的甲基供体，参与多种生化反应。本文详细介绍了SAM竞争法ELISA试剂盒的工作原理、实验流程、技术特点及应用领域，为研究人员提供全面的技术参考。

1. 引言

S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为生物体内关键的甲基供体，在DNA甲基化、神经递质合成、磷脂代谢等过程中发挥重要作用。准确测定SAM水平对于研究甲基化代谢、肝脏疾病、神经系统疾病等具有重要意义。竞争法ELISA以其高特异性、高灵敏度和操作简便等优势，成为检测SAM的重要工具。

2. SAM竞争法ELISA试剂盒工作原理

竞争法ELISA基于以下原理：

1. 微孔板预先包被SAM类似物或结合蛋白

2. 样品中的SAM与酶标记的SAM竞争结合有限数量的抗体结合位点

3. 样品中SAM浓度越高，与抗体结合的酶标SAM越少

4. 加入底物显色后，通过测定吸光度值，其强度与样品中SAM浓度呈反比

反应公式可表示为：

[Ab] + [SAM*] + [SAM] ↔ [Ab-SAM*] + [Ab-SAM]

其中Ab为抗体，SAM*为酶标SAM，SAM为待测样品中的SAM试剂盒组分与保存

未开封的试剂盒保存在2-8度，不得使用过期试剂盒。

标准品浓度依次为：120、60、30、15、7.5、0 ng/mL.

其他用品

1、 酶标仪（450nm）

2、 精密移液器及一次性吸头

3、 蒸馏水

4、 洗瓶或者自动洗板机

5、 37℃水浴锅或恒温箱

6、 500ml量筒

样品的采集和储存

以下只是列出样品采集和保存的一般指南。所有样本采集保存过程中，不得使用叠氮钠做为防腐剂。

1、 细胞培养上清：4000rpm条件下离心20min，去除细胞颗粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反复冻融。

2、 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，4000rpm条件下离心20min，小心地分离出血清，保存在-20℃以下，避免反复冻融。

3、 血浆：肝素，EDTA，或柠檬酸钠作为抗凝剂。在4000rpm条件下，离心20分钟取上清，血浆保存在-20℃以下，避免反复冻融。

样本收集后，无法一次检测完毕，请按一次用量分装冻存，避免反复冻融，使用时在室温下解冻，确保样品均匀充分解冻。

4、 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1: 9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9 mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎或反复冻融。最后将匀浆液5000×g离心 5-10分钟，取上清检测。

5、 细胞提取液：贴壁细胞用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5分钟后收集细胞；悬浮细 胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS洗涤3次。每 1×106 个细胞中加入150-200μLPBS重悬并通过反复冻融使细胞破碎(若含量很低可减少PBS的体积)。将提取液于1500×g离心10分钟，取上清检测。  

6、 其他生物体液：1000×g 离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

试剂准备

1、 使用前，所有的组分都要至少复温60min，确保充分复温到室温。

2、 浓缩洗涤液：从冰箱取出的浓缩洗涤液，会有结晶产生，这属于正常现象，水浴加热使结晶溶解。浓缩洗涤液与蒸馏水，按1:20稀释，即1份的浓缩洗涤液，添加19份的蒸馏水。

3、 底物：底物液A和B，在使用前，按1:1体积充分混合，混合后15分钟内使用。

操作程序

所有试剂和组分都先恢复到室温，标准品、质控品和样品，建议做复孔。

1、 按前面说明书描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液。

2、 从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。

设置标准品孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL，空白孔不加，样本孔加待测样本50μL。

3、除空白孔外，标准品孔和样本孔，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗原100μL。

4、 用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5、 揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置20S，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复5次。若使用自动洗板机，请按洗板机操作程序进行洗板，添加浸泡30s的程序，可以提高检测的精度。洗板结束，加底物前，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干反应板。

6、 将底物A和B按1:1体积充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱温育15min。

7、 所有孔加入终止液50μL，在酶标仪上读取各孔吸光度（OD值）。

结果计算

1、 以标准品浓度做为横坐标，对应的吸光度（OD值）作为纵坐标，利用计算机软件，采用四参数Logistic曲线拟合（4-pl），创建标准曲线方程，通过样本的吸光度（OD值），利用方程计算样品的浓度值。

2、 如果样品被稀释，通过上述方法测的浓度值，要乘以稀释倍数，才是样品的最终浓度。

试剂盒性能指标

1、物理性能

试剂盒的各液体组分应澄清透明、无沉淀或者絮状物。微孔板铝箔袋应真空包装，无破损漏气。

2、剂量反应曲线线性

校准品剂量反应曲线相关系数r值，大于等于0.9900。

3、精密度

批内精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在同一个板块内精度评估。批内变异系数CV%小于10%。

批间精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在不同板块内精度评估。批间变异系数CV%小于15%。

4、灵敏度

检出剂量小于0.1 ng/mL。

5、回收率

三组已知的高、中、低浓度样品，进行五次在同一个板块内回收率评估，回收率在85%-115%之间。

6、特异性

本试剂盒识别天然和重组S-腺苷甲硫氨酸（SAM），与结构类似物无交叉。

7、稳定性

2℃-8℃保存，有效期6个月。

8、 检测范围

3.75 ng/mL - 120 ng/mL